IF 15.9｜第四军医大学韩骅教授团队发现内皮细胞中SPEN通过促进rRNA基因转录调控肿瘤血管生成

2023年8月，第四军医大学韩骅教授团队在J Clin Invest（IF 15.9）在线发表了题为“Repression of rRNA gene transcription by endothelial SPEN deficiency normalizes tumor vasculature via nucleolar stress”的研究成果。研究首次报道了内皮细胞中转录共抑制分子SPEN ( split end)可以调控血管生成，揭示了SPEN通过促进rRNA基因转录和核糖体生物发生，诱导肿瘤血管生成，同时阐明了RNPI（RNA聚合酶I）可能是肿瘤血管正常化治疗的有效靶点。

1 研究背景

血管生成是生理和病理组织血管化所必需的，肿瘤血管生成是由异常高水平的促血管生成因子驱动的，从而形成丰富但混乱的血管系统，促进肿瘤的生长和转移，减弱大多数现有疗法的疗效，抗血管生成疗法（AAT）可以使混乱的肿瘤血管结构和功能正常化，从而抑制肿瘤恶性并促进其他治疗。有研究表明核糖体的生物发生是血管生成所必需的，但潜在作用机制尚不清楚。SPEN负调控多种信号通路，且在发育中发挥重要作用，然而其在血管生成中的作用仍未阐明。

2 研究结果

1、敲低SPEN抑制EC增殖和血管生成

小鼠组织切片免疫荧光显示SPEN在ECs中表达，在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中，SPEN仅在细胞核中检测到，SPEN敲低导致HUVECs增殖减少，细胞分裂停滞且细胞迁移减少；RNA测序分析证实了SPEN敲低的HUVECs中细胞周期相关基因的下调。这些数据表明，SPEN是EC增殖所必需的。血管生成基因在SPEN敲低的HUVECs中下调，体内实验表明SPEN敲除抑制小鼠血管生成，并且EC增殖减少，表明内皮细胞SPEN通过促进EC增殖是血管生成所必需的。基因表达谱等结果显示，p53蛋白表达水平与SPEN呈负相关，SPEN敲低通过激活p53抑制EC增殖。

2、SPEN敲低下调pre-rRNA转录，引发核仁应激激活p53通路

SPEN是ECs中维持核仁结构和功能所必需的，SPEN缺乏会触发核仁应激，从而激活ECs中的p53。进一步分析发现，pre-rRNA和加工的18S、5.8S和28S rRNA在SPEN敲低的HUVECs中下调，提示SPEN基因敲低下调rRNA基因表达，导致核仁应激。研究表明，转录前起始复合物的组装需要CTCF、DNA异构酶和内聚蛋白/凝聚蛋白复合物，利用腺病毒过表达CTCF并没有上调HUVECs中pre-rRNA，最后，链特异性RT-qPCR显示，在SPEN敲低的HUVECs中，pRNA水平大幅增加，深入研究表明SPEN敲低可上调pRNA以减弱rRNA转录，从而导致ECs中的核仁应激和p53激活。

3、内皮细胞SPEN敲除可抑制肿瘤生长并导致肿瘤血管正常化

作者研究发现，在人和小鼠模型中，内皮SPEN高表达水平与肿瘤进展呈正相关。接下来，作者利用LLC或B16-F10黑色素瘤细胞接种SPEN缺陷小鼠和对照小鼠，结果发现，与对照组相比，内皮细胞SPEN缺陷小鼠的肿瘤生长迟缓，肿瘤细胞增殖和组织缺氧明显减弱；转移性评估结果表明内皮细胞SPEN缺乏显著降低肺转移。以上结果表明内皮细胞SPEN缺陷抑制肿瘤生长和转移。作者评估内皮细胞SPEN缺陷后的肿瘤血管表型，发现肿瘤血管正常化。顺铂(CDDP)是目前应用最广泛的癌症化疗药物之一，肿瘤血管正常化有望提高CDDP治疗肿瘤的疗效。给予CDDP治疗，内皮细胞SPEN缺乏可显著增强CDDP的疗效，如肿瘤生长减少和肿瘤组织坏死增加。此外，p53缺乏破坏了SPEN缺陷诱导的肿瘤血管正常化；进一步实验表明SPEN缺陷通过激活p53使肿瘤血管正常化。

4、RNPI抑制剂CX-5461使肿瘤血管正常化并改善化疗效果

作者研究发现SPEN缺失诱导的pRNA上调导致的核仁应激可以使肿瘤血管正常化，因此可以作为AAT的靶点。进一步利用pRNA ASO在体外验证其对EC的作用，发现上调pRNA可以使肿瘤血管正常化，而下调pRNA则具有相反的作用。rRNA基因转录是由RNPI驱动的，作者评估了临床试验中的RNPI抑制剂CX-5461是否可以诱导肿瘤血管正常化。给药后发现小鼠肿瘤组织血管密度降低，周细胞和基底膜覆盖率增加，血管重建，肿瘤血管改善，EC连接蛋白VE-cadherin和ZO-1表达增加。此外，CX-5461处理增加了血管灌注并减弱了渗漏。当CX-5461与CDDP联合应用时，CX-5461可增强CDDP的疗效。以上结果表明，CX-5461抑制RNPI可诱导肿瘤血管正常化，并改善化疗效果。

本研究发现SPEN是血管生成所必需的，SPEN敲低可通过上调pRNA抑制pre-rRNA转录，进而引发核仁应激，激活p53信号通路。在内皮细胞中敲除SPEN可抑制肿瘤生长和转移并使血管正常化，从而促进了化疗药物顺铂的疗效，揭示RNPI可能是肿瘤血管正常化治疗的靶点。