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慢病毒包装服务


慢病毒(lentivirus)是逆转录病毒的一种,是RNA病毒,需要相对较长的孵育时间,所以称之为“慢”病毒。慢病毒区别于一般的逆转录病毒,它可以感染分裂和非分裂细胞,并能将外源基因整合到宿主基因组上实现长期稳定的表达,是体外和体内基因传递的有效工具。


产品自2013年面市后,维真生物承接了很多慢病毒包装项目,且生产工艺经过了多次优化,滴度、纯度和稳定性方面得到了很大改善。目前,维真生物可提供体内外实验所需的各种规格慢病毒,以满足客户多样化的实验需求。下面是具体服务内容(目录价仅为病毒包装费用):


服务编号

服务类型

规格

目录价

货期

WZ060001

小包装、OE & CRISPR/Cas9

滴度≥1×10E8 TU/ml;体积1ml

¥7,056.00

2-3周

WZ060002

大包装、OE & CRISPR/Cas9

滴度≥1×10E9 TU/ml;体积1ml

¥15,000.00

2-3周

WZ060003

小包装、单shRNA

滴度≥1×10E8 TU/ml;体积1ml

¥3,600.00

2-3周

WZ060004

大包装、单shRNA

滴度≥1×10E9 TU/ml;体积1ml

¥10,800.00

2-3周

WZ060005

小包装、shRNA(3保1)

滴度≥1×10E8 TU/ml;体积1ml

¥9,600.00

2-3周

WZ060006

大包装、shRNA(3保1)

滴度≥1×10E9 TU/ml;体积1ml

¥28,800.00

2-3周


*如您对上述服务感兴趣,请您点击“欢迎垂询”留下您的信息,我们将为您提供具体实验方案和项目价格。


相关服务: 克隆服务 基因表达分析服务 稳定细胞系建立



↓↓ 分以下几个部分做详细介绍 ↓↓

  • 病毒简介
  • 包装流程和质控
  • 服务特色
  • 服务流程
  • 相关资料
  • FAQs
  • 相关产品
  • 客户文章
慢病毒结构

慢病毒是一种有包膜的RNA病毒,直径为80-120nm,呈二十面体对称结构、球形。病毒颗粒最外层是包膜(包膜蛋白决定了感染细胞的类型),再往里依次为基质蛋白和衣壳,最里面是两条相同的正股RNA链和酶(逆转录酶、整合酶和蛋白酶)。

右图是慢病毒的结构示意图:

维真生物-LV结构示意图 & 慢病毒的结构示意图



慢病毒基因组

慢病毒含有复杂的基因组。以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为例,HIV是一种单链RNA病毒,其基因组长度约为9.7kb。基因组两端各有一个反向末端重复序列(inverted terminal repeat, ITR),中间包括gag、 pol、env 3个结构基因及tat、rev、nef、vif、vpr、vpu 6 个调节基因。下图是HIV-1基因组的示意图:




慢病毒是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。出于包装能力和安全性考虑,目前慢病毒载体已发展了很多代,其中2代和3代是目前大家应用比较广的。慢病毒载体的包装容量为7-8kb,但是通常超过3kb的话会明显影响慢病毒的滴度。下面是2代和3代慢病毒系统的示意图:





慢病毒感染细胞的过程

慢病毒感染细胞的第一步是通过包膜蛋白与细胞表面受体结合。慢病毒与宿主细胞膜融合后释放结构蛋白、酶蛋白和病毒核心。病毒RNA在逆转录酶的作用下逆转录并与整合酶形成整合前复合物。整合前复合物进入细胞核后,整合酶催化其整合至宿主基因组。外源基因前启动子驱动其在细胞质中表达。

下图是慢病毒感染细胞的示意图:





慢病毒特点

1. 慢病毒有广泛的宿主范围,能够有效地感染分裂细胞、非分裂细胞,特别适合于一些难转染的细胞(如原代细胞、干细胞、不分化的细胞)和对腺病毒感染具有较强免疫反应的细胞(如树突状细胞、单核细胞和间充质干细胞)等,能大大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加。

2. 慢病毒能将外源基因有效地整合入宿主染色体上,介导目的基因稳定、长期的表达。因此,可以利用慢病毒建立稳定细胞株。

3. 适用范围更广,不仅能用于体外实验,还能用于活体动物模型,尤其是动物成瘤实验。




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维真生物采用的包装系统是2代包装系统,即三质粒系统,该系统包括1个包装质粒(psPAX2)、1 个包膜质粒(pMD2G)、1个目的基因质粒和1株包装细胞(293T cell)。下图是2代慢病毒包装系统的示意图:


维真生物-二代慢病毒包装系统示意图



慢病毒包装流程

维真生物可以提供从LV质粒构建至病毒包装的所有服务外包项目。而且,维真生物全套的LV载体和表达系统可用于体内和体外表达human/mouse/rat ORFs,lncRNA,circRNA,shRNAsCRISPR/gRNA。下面是LV从头合成的流程:


维真生物-慢病毒包装流程



慢病毒纯化

维真生物采用蔗糖密度梯度超速离心法对LV病毒进行纯化。它利用不同颗粒之间存在的沉降系数差,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带。下图是LV病毒纯化的示意图:


维真生物-慢病毒纯化的示意图




慢病毒滴度检测

维真生物的LV病毒采用孔稀释法进行标定。

孔稀释法是通过数荧光的方法测定慢病毒滴度,得到的结果为有感染能力的慢病毒颗粒数。下图是维真某慢病毒(3.20×108TU/mL)孔稀释法测滴度时的荧光图:




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1. 载体全:

多种表达载体、多种标签载体和多种报告基因可供客户选择。

2. 货期短:

Human ORF cDNA克隆和Human microRNA克隆可在2-3天穿梭至慢病毒载体,个性化定做慢病毒;

3. 服务优:

可根据客户具体实验,由公司专业技术人员提供载体构建方案,提供特殊定制服务。

4. 赠送:

赠送慢病毒助感染试剂,这对于难感染细胞有很大的帮助,下图是助感染试剂在HepG2和CNE2细胞中的效果图。


维真生物慢病毒助感染试剂在HepG2和CNE2细胞中的效果图





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慢病毒包装服务询价单(点击下载)




1、什么情况下选用慢病毒?

慢病毒的宿主范围比较广,既能感染分裂细胞,也能感染非分裂的细胞,在体内外研究中均可选择慢病毒作为病毒载体。此外,慢病毒也是构建稳转株的理想病毒。


2、慢病毒载体可插入多大的 ORF 片段?

一般情况下,慢病毒载体可容纳8 kb插入片段。然而,插入的ORF基因大于4 kb时会大大降低病毒的包装效率,进而影响病毒滴度甚至基因表达。


3、用于慢病毒感染的细胞接种量是多少?

将状态良好的目的细胞接种到24孔板,细胞浓度一般为1×105/mL细胞,接种细胞数量需要考虑到细胞活力因素、状态因素、生长快慢因素、分裂因素等,一般是保证病毒感染时细胞汇合率达到50%-70%为佳。


4、什么是 MOI ?

MOI (multiplicity of infection),即感染复数,指的是感染时病毒与细胞数量的比值。一般认为MOI是一个比值,没有单位。


5、慢病毒是否能够稳定表达基因?

是的。慢病毒能将外源基因整合到宿主基因组中,不会随着细胞分裂传代而丢失,因此能实现外源基因的长期稳定表达。


6、维真慢病毒的包装周期是多久?

如果客户提供构建好的慢病毒载体,那么包装时间一般为2周左右,若包含前期载体构建等的时间,时间大概在5周左右。


7、慢病毒感染细胞后,目的基因的表达什么时间达到峰值?

慢病毒感染目的细胞后,一般情况下,在72-96h目的基因的表达能达到峰值,但是对于一些特殊细胞、如增殖传代比较慢的细胞,蛋白表达达到峰值则需要更长的时间。


8、怎样提高慢病毒的感染效率?

细胞良好的生长状态和感染时适合的 MOI 值是达到高感染效率的保证。一般可以通过提高感染时的 MOI 值来提高病毒的感染效率,必要时可在感染时加入助感染试剂ADV-HR来提高慢病毒的感染效率。


9、慢病毒感染后,细胞状态很差,甚至出现死亡,为什么?

慢病毒会对细胞造成一定的毒性,不同细胞对毒性的耐受力不同。建议调整并降低感染时使用的MOI值,即可在细胞准备时增加铺板细胞的汇合率(可提高至 70%),调整感染时加入的病毒量。此外,还可选择在感染4小时后换液,用新鲜的完全培养液继续培养观察。


10、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒三种病毒有什么区别?如何选择?

对于转染困难的细胞,科研工作者通常会选择病毒来导入目的基因。目前,腺病毒、慢病毒和腺相关病毒是常用的病毒载体工具。那么如何选择适合您实验体系的病毒工具,请参考下面3种病毒工具的比较:


病毒表达系统

腺病毒

腺相关病毒

慢病毒

病毒基因组

dsDNA

ssDNA

ssRNA

病毒外壳

具有包膜蛋白

基因组大小

38-39kb

5kb

9kb

包装容量

7.5kb

4.5kb

6kb

感染的细胞类型

分裂细胞和非分裂细胞

分裂细胞和非分裂细胞

分裂细胞和非分裂细胞

整合至宿主基因组

非整合

非整合

整合

表达丰度

高水平表达

高水平表达

中到高水平表达

表达时间

快(1-2天)

1-2周(体内)

慢(2-4天)

外源基因持续表达时间

短暂

潜在的持久

长久

免疫反应

较高

极低

相对病毒滴度

10E10pfu/mL

10E13VG/mL

10E8TU/mL

生物安全等级

BSL-2

BSL-1

BSL-2



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慢病毒-过表达:

1.

Cell Death & Disease. (IF=6.304). Liu, et al. (2020). Long noncoding RNA SNHG12 promotes tumour progression and sunitinib resistance by upregulating CDCA3 in renal cell carcinoma.[华中科技大学同济医学院附属协和医院pLent-SNHG12-GFP-Puro & pLent-shSNHG12-GFP-Puro 肾癌细胞RCC cells]

2.

Cell Death & Disease. (IF=6.304). Liu, et al. (2020). Activation of STAT3 is a key event in TLR4 signaling-mediated melanoma progression.[香港浸会大学 lentivirus-CA-TLR4, fused with Myc and Flag tags 黑色素瘤细胞A375 cells]

3.

Cell Death & Disease. (IF=6.304). Wang, et al. (2019). LXRα promotes cell metastasis by regulating the NLRP3 inflammasome in renal cell carcinoma.[华中科技大学同济医学院附属协和医院 pLent-LXRα-GFP-Puro & pLent-GFP-sh-LXRα-Puro 肾癌细胞RCC cells]

4.

Biochemical and Biophysical Research Communications. (IF=2.985). Zhu, et al. (2019). MicroRNA-506 inhibits the proliferation and invasion of mantle cell lymphoma cells by targeting B7H3.[北京大学第三医院 lent-miR-506 套细胞淋巴瘤细胞]

5.

Molecular Cancer. (IF=15.302). Tan, et al. (2019). PIWI-interacting RNA-36712 restrains breast cancer progression and chemoresistance by interaction with SEPW1 pseudogene SEPW1P RNA.[中山大学 pLent-Puro-GFP-piR-36712 人乳腺癌细胞MCF7和ZR75-1]

6.

Advanced Science. (IF=15.84). Lai, et al. (2018). A Modular Assembly of Spinal Cord–Like Tissue Allows T argeted Tissue Repair in the T ransected Spinal Cord. [中山大学 pLent-EF1a-NT-3-Flag-CMV-GFP-P2A-Puro & pLent-EF1a-TrkC-Flag-CMV-GFP-P2A-Puro & pLent-EF1a-CNTF-Flag-CMV-GFP-P2A-Puro 神经干细胞NSCs & 少突胶质前体细胞OPCs 脊髓损伤]

7.

Theranostics. (IF=8.579). Mai, et al. (2018). PIWI-interacting RNA-54265 is oncogenic and a potential therapeutic target in colorectal adenocarcinoma.[中山大学 pLent-Puro-GFP-piR-54265 人结肠癌细胞HCT116和LoVo]

8.

Toxicology Letters. (IF= 3.569). Yan, et al. (2018). Inhibitory Effect of PXR on Ammonia-induced Hepatocyte Autophagy via P53.[福建医科大学附属协和医院 pLent-EF1a-PXR-CMV-GFP & pLent-U6-shPXR-GFP-Puro 人肝细胞HL-7702 和人肝癌细胞 BEL-7404 肝自噬]


慢病毒-基因沉默:

1.

Cell Death & Disease. (IF=6.304). You, et al. (2020). GADD45α drives brown adipose tissue formation through upregulating PPARγ in mice.[浙江大学 Lenti-sh-Gadd45a BAT cell & Ad-Gadd45a SVF细胞 肥胖]

2.

Journal of Neuroinflammation. (IF=5.793). Zeng, et al. (2019). Lentivirus-mediated downregulation of α-synuclein reduces neuroinflammation and promotes functional recovery in rats with spinal cord injury.[北京大学第三医院 LV-SNCA-shRNA 脊髓损伤]

3.

Cell Discovery. (IF=6.255). Liao, et al. (2019). USP10 modulates the SKP2/Bcr-Abl axis via stabilizing SKP2 in chronic myeloid leukemia.[广州医科大学 pLent-4in1shRNA(For USP10/SKP2)-GFP & pLent-EF1a-FH-CMV-GFP containing SKP2-CDS, SKP2 (S72A) CML cells MOI=10 慢性粒细胞白血病CML]

4.

International Journal of Biological Sciences. (IF=4.858). Zheng, et al. (2019). Cathelicidin-related antimicrobial peptide protects against cardiac fibrosis in diabetic mice heart by regulating endothelial-mesenchymal transition.[郑州大学附属第一医院lentiviruses-shAMPKa1 心肌注射 糖尿病性心肌病]

5.

Oncogene. (IF=7.971). Liao, et al. (2018). Growth arrest and apoptosis induction in androgen receptor-positive human breast cancer cells by inhibition of USP14-mediated androgen receptor deubiquitination.{广州医科大学 pLent-4in1shRNA[For human USP14 (NM-005151)]-GFP 人乳腺癌细胞 MOI=10 雄激素受体阳性乳腺癌}

6.

J Mol Cell Cardiol. (IF= 4.133). Li, et al. (2017). TCONS_00075467 modulates atrial electrical remodeling by sponging miR-328 to regulate CACNA1C.[山东大学千佛山医院 4in1shRNA慢病毒lenti-RNAi-TCONS_00075467 原代心肌细胞 心房颤动AF的电重构]



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