敲入细胞系建立

敲入细胞系简介

敲入细胞系是指将外源基因通过同源末端重组的方式，精准的插入到基因组特定位点中，并通过筛选和验证等过程获得稳定表达外源基因的细胞。它利用特定的工具和方法，如CRISPR/Cas9 donor系统，在特定靶点断裂DNA双链，并将外源DNA精确地插入到靶点中，具有精确插入和稳定遗传的特点，在基因功能研究、重组蛋白定位、药物筛选及靶点验证、肿瘤治疗等生物学研究中发挥重要作用，被广泛应用于生物医学研究、农业改良、生物工程等领域，为人类疾病治疗、作物品种改良和生物产业发展提供了新的可能性。

敲入细胞系构建原理

在外源基因两端分别添加靶点DNA两侧的同源片段并构建到donor载体中，然后将CRISPR/Cas系统和donor载体共同转入细胞内。CRISPR/Cas系统在特定靶点切割DNA双链，产生DNA双链断裂（DSB），进而触发细胞的DNA修复过程，当通过HDR修复DSB时，携带外源基因的donor载体能作为HDR的模板进行DNA修复，进而实现将外源基因精准的插入到特定靶点。然后利用载体对应抗性完成药筛后进行单克隆筛选（若敲入了荧光报告基因也可通过观察荧光进行初步筛选），并通过靶位点扩增验证和测序验证筛选出成功实现靶位点片段敲入的阳性单克隆。

CRISPR/Cas9基因敲入机制（Yanxin X et al., 2022）

敲入细胞系应用

①基因功能研究领域：相较于过表达细胞系，敲入细胞系中外源基因在基因组的插入位点是已知的，可以避免随机整合的风险，实验结果更稳定可靠，可用于基因功能和蛋白定位研究。

②基因和细胞治疗领域：CAR-T，CAR-NK，IPSC敲入细胞系能保证无整合风险，具有更高的安全性和稳定性，可用于基因和细胞治疗领域。

服务流程

服务优势

丰富的项目经验：多种哺乳动物细胞系构建经验，确保高成功率。

稳定的生产工艺：采用gRNA-Cas9 RNP体系和donor载体构建敲入细胞，具有稳定高效的同源重组效率。

完善的质检流程：PCR验证和测序验证相结合，保证外源基因准确插入。