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shRNA克隆


研究基因的功能,科研工作者通常从两方面着手:功能获得性和功能丧失性。而RNAi技术就是功能丧失性研究的一种。它是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象,当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(dsRNA)时,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。它是研究转录后调控的有效工具,可用于功能基因组研究以及基因治疗等临床应用。为了灵活满足研究者不同科研项目的需求,维真生物可提供多种shRNA克隆服务,具体服务内容见下面:


服务编号

服务类型

规格

目录价

货期

WZ030001

单shRNA质粒构建

5ug质粒+500ul菌液

¥1200.00

2-3周

WZ030002

套餐shRNA质粒构建(3保1)

5ug质粒+500ul菌液

¥2160.00

2-3周

WZ030003

套餐shRNA质粒构建(4保1)

5ug质粒+500ul菌液

¥2880.00

2-3周

WZ030004

2 in 1 shRNA质粒构建

5ug质粒+500ul菌液

¥2400.00

2-3周

WZ030005

3 in 1 shRNA质粒构建

5ug质粒+500ul菌液

¥2160.00

2-3周

WZ030006

4 in 1 shRNA质粒构建

5ug质粒+500ul菌液

¥2880.00

2-3周

WZ030007

诱导性shRNA质粒构建(Dox、Cre……)

5ug质粒+500ul菌液

¥1200.00

2-3周

WZ020008

mir30-based shRNA质粒构建

5ug质粒+500ul菌液

¥1200.00

2-3周


*注:shRNA质粒若需要改造,需要额外增加质粒改造费用


*如您对上述服务感兴趣,请您点击“欢迎垂询”留下您的信息,我们将为您提供具体实验方案和项目价格。


相关服务: 腺病毒包装 慢病毒包装 腺相关病毒 shRNA干扰效果验证



↓↓ 分以下几个部分做详细介绍 ↓↓

  • 服务简介
  • 服务特色
  • 服务流程
  • 相关资料
  • FAQs
  • 相关产品
  • 客户文章

近年来,RNAi已成为研究基因功能不可或缺的工具。其应用领域已经从基因组学研究逐步扩展到医学领域并作为基因治疗手段。RNAi作为这么重要的分子生物学技术,其原理如何?如下图所示:外源dsRNA进入细胞后在Dicer酶的作用下产生双链siRNA,双链siRNA解旋后,其反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),RISC具有结合和切割mRNA的作用,从而介导RNA干扰的过程。





维真生物-RNAi原理图


根据RNAi的作用机制,RNAi实验的研究步骤大体分为4步,详见下图:


维真生物-RNAi实验的研究步骤


除了化学合成siRNAs外,维真生物可以提供Vector-based shRNAs构建、导入细胞和抑制效果验证服务,功能验证服务需要根据客户的实验需求进行现场评估。RNAi的效应分子是siRNA。不管您选择什么干扰方式,最终均会形成siRNA,然后与RISC多蛋白复合物组装成有活性的RISC,发挥基因沉默功能。*shRNA(short hairpin RNA),即短发卡RNA,是可以克隆至表达载体并表达siRNA双链的RNA分子;siRNA(small interfering RNA),即小干扰RNA,是21-23nt的双链RNA复合物,每条链的3’端有2-3个突出的非配对碱基且3’端为羟基,5’端为磷酸,这个结构具有能被Rnase Ⅲ样活性的核酸酶识别切割的特征,从而引发高度保守的Dicer 家族的RNaseⅢ的识别作用进而特异切割dsRNA产生基因沉默作用。下面是siRNA(上图)和shRNA(下图)的结构示意图:









维真生物-siRNA和shRNA图


siRNA与shRNA都可以有效沉默或抑制目标基因的表达,但是作用机制还是有一些区别的,具体内容详见下图:



siRNA和shRNA的区别:


比较项

shRNA

siRNA

稳定性

低、容易降解,寿命短

作用时效

作用时间较长,持续数星期甚至更长

作用时间较短,一般为1周左右

脱靶率

导入细胞方式

质粒载体,普通转染;病毒导入,克服转染困难细胞的导入;

普通转染;转染困难细胞的细胞难转染

表达方式

聚合酶II型和III型启动子驱动;可使用诱导表达系统;
可以与报告基因共表达,可视化细胞导入效率

直接化学合成

抑制效果检测时间

取决于靶蛋白的半衰期



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Vector-based shRNAs,多数由聚合酶III型启动子驱动表达。常见的聚合酶III型启动子包括U6和H1,这类启动子缺少组织特异性,主要用来启动比较短的RNA,且末端需要4-6个连续的T来终止转录。下面是Vector-based shRNAs的结构示意图:




关于Vector-based shRNAs,为了满足广大科研工作者不同的实验需求,维真生物可以提供多种shRNA质粒构建服务:

单个shRNA载体构建,客户提供高效siRNA靶点,维真生物公司根据靶点构建shRNA质粒。

套餐shRNA质粒构建,维真生物根据客户提供的靶基因信息构建3保1或者4保1 shRNA质粒。

多和1 shRNA载体构建特色1维真生物根据客户提供的高效siRNA靶点和靶基因信息构建多和1 shRNA质粒。

以4 in 1 shRNA为例:该服务是将4条shRNA序列克隆至1个shRNA质粒。维真生物的4 in 1 shRNA质粒不仅可以用于转染细胞,也可包装成病毒用于病毒导入宿主。


4 in 1 shRNA下调GFP表达

4 in 1 shRNA下调RCAN1表达


优势

1)将4个作用于同一基因不同mRNA部位的shRNA序列克隆进同一shRNA载体,增加了目的基因下调表达的概率。

2)将高效的、作用于2-4个靶基因的shRNA序列克隆进同一shRNA载体,实现2-4个基因同时下调表达的目的。

3)无需序列筛选,大大减少实验工作量。

4)多种4 in 1 shRNA病毒载体的选择,包括腺病毒穿梭载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体,实现不同的实验目的。



劣势

针对同一目的基因的4条shRNA序列,不能具体确定哪条shRNA序列的干扰效果最好。

mir30-based shRNA质粒构建特色2实现组织特异性基因沉默。

shRNA的RNAi机制与microRNA成熟机制一样,因此,shRNA也可以由聚合酶II型启动子驱动表达。这类启动子包括广谱启动子(如CMV、CAG和EF1a等)和组织特异性启动子(如hSyn、TBG和cTnT等),可以启动较大的基因转录,且需要polyA等转录终止信号。维真生物可以根据客户指定的启动子和提供的shRNA序列将其构建至mir30-based shRNA质粒。mir30-based shRNA结构示意图如下:





诱导性shRNA质粒构建特色3包括Cre/loxp,Flp/Frt和Tet on等诱导系统。

以Cre on shRNA为例,该服务是使用FLEX(flip-excision)系统实现shRNA诱导表达。FLEX是一种非常强大的控制基因表达的方法,它采用2对异质、反向的loxp位点(loxP和lox2272),经过DNA翻转产生带有不同loxp位点的DNA翻转,防止进一步的DNA翻转,实现目标基因不可逆的翻转。维真生物采用改良版FLEX,将2对异质、反向的loxp位点置于启动子两边,通过cre作用决定启动子方向,通过不同荧光蛋白可视化shRNA的表达。






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1. 维真生物载体的启动子是哪些?

维真生物载体使用两类启动子:人源的U6启动子和H1启动子。


2. 人源的U6启动子和H1启动子是否可以应用于大鼠、小鼠或其他哺乳动物细胞中?

可以的。人源的U6启动子和H1启动子之间没有物种差别。这些启动子在大鼠、小鼠或其他哺乳动物细胞中的启动效率也非常好。


3. 你们保证siRNA干扰载体的效果吗?

如果针对一条被干扰的基因设计三条或四条shRNA,维真生物承诺在客户细胞转染效率达80%以上的条件下,如果3个或者4个靶点shRNA没有任何一个对靶基因的抑制效率在mRNA水平上达到70%以上,公司将免费重新设计并构建4个新的shRNA质粒,需要增加一个实验周期。若重新构建的shRNA载体仍然没有任何一个对靶基因mRNA的抑制效率能够达到70%,可能和该基因有关,公司仅收取客户单次shRNA载体构建费用。


4. 针对一条被干扰的基因,你们建议订购几个干扰载体?

针对一条被干扰的基因,我们建议至少构建3个干扰载体。


5.我如何监控转染效率?

您可以采用维真生物带有GFP标记的shRNA载体直接地监控转染效率。


6. 维真生物能够利用来自其它公司的载体构建vector-based shRNA载体吗?

可以,不过需要您提供给我们载体。


7. Vector-based shRNA的交付周期为多久?

交付周期为2-3周。


8. 使用病毒感染细胞的优势是什么?

病毒介导的shRNA可以克服一些由于靶细胞影响RNAi的问题,如原代细胞、成纤维细胞和树突状细胞等,这些细胞的转染效率低。




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1.

Cell Death and Disease. (IF=6.304). Tian, et al. (2020). MYC-regulated pseudogene HMGA1P6 promotes ovarian cancer malignancy via augmenting the oncogenic HMGA1/2.[山东大学齐鲁医院Tet-on-sh-HMGA1P6 shRNA vector (pZIP-TRE3G-ZsGreen-Puro) 卵巢癌]

2.

INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY. (IF=3.899). Cui, et al. (2019). TGF-β-induced long non-coding RNA MIR155HG promotes the progression and EMT of laryngeal squamous cell carcinoma by regulating the miR-155-5p/SOX10 axis.[河北医科大学第二医院耳鼻咽喉科 4 sh-MIR155HG LSCC cells(TU177 & AMC-HN-8) 喉癌]

3.

Cerebral Cortex. (IF=5.043). Lu, et al.(2017). Neuritin Enhances Synaptic Transmission in Medial Prefrontal Cortex in Mice by Increasing CaV3.3 SurfaceExpression.[复旦大学 NRN1 AAV-4 in 1 shRNA-GFP 突触传递]

4.

Journal of Cellular and Molecular Medicine. (IF=4.486). Wang, et al. (2020). Inhibition of PFKFB3 suppresses osteoclastogenesis and prevents ovariectomy-induced bone loss.[华中科技大学同济医学院同济医院骨科 murine PFKFB3 Adenoviruses-4 in 1 shRNA-GFP 骨髓源性巨噬细胞BMMs MOI=50 破骨细胞相关疾病]

5.

EBioMedicine. (IF=5.736. Li, et al. (2019). Inhibition of AZIN2-sv induces neovascularization and improves prognosis after myocardial infarction by blocking ubiquitin-dependent talin1 degradation and activating the Akt pathway.[南方医科大学南方医院AZIN2-sv Adenoviruses-4 in 1 shRNA-GFP 人脐静脉内皮细胞HUVECs MOI=100 新血管形成]

6.

Bone. (IF=4.147). Zhao, et al. (2018). YAP1 is essential for osteoclastogenesis through a TEADs-dependent mechanism.[华中科技大学同济医学院同济医院骨科murine YAP1 Adenoviruses-4 in 1 shRNA-GFP 骨髓源性巨噬细胞BMMs & RAW264.7 cells破骨细胞生成]

7.

Cardiovascular Research. (IF=8.168. Li, et al. (2018). Loss of AZIN2 splice variant facilitates endogenous cardiac regeneration.[南方医科大学南方医院 AZIN2-sv Adenoviruses-4 in 1 shRNA-GFP 心肌细胞CMs MOI=100 & 大鼠心肌注射 心脏再生]

8.

Cell Discovery. (IF=6.255). Liao, et al. (2019). USP10 modulates the SKP2/Bcr-Abl axis via stabilizing SKP2 in chronic myeloid leukemia.[广州医科大学pLent-4in1shRNA(For USP10/SKP2)-GFP & pLent-EF1a-FH-CMV-GFP containing SKP2-CDS, SKP2 (S72A) CML cells MOI=10 慢性粒细胞白血病CML]

9.

Oncogene. (IF=7.971). Li, et al. (2019). MicroRNA-150 Modulates Adipogenic Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells by Targeting Notch3[中国医科大学 pLent-4in1shRNA[For human USP14 (NM-005151)]-GFP 人乳腺癌细胞 MOI=10 雄激素受体阳性乳腺癌]

10.

Oncogene. (IF=7.971). Liao, et al. (2018). Growth arrest and apoptosis induction in androgen receptor-positive human breast cancer cells by inhibition of USP14-mediated androgen receptor deubiquitination.[广州医科大学 pLent-4in1shRNA[For human USP14 (NM-005151)]-GFP 人乳腺癌细胞 MOI=10 雄激素受体阳性乳腺癌]

11.

J Mol Cell Cardiol. (IF= 4.133). Li Z, et al. (2017).TCONS_00075467 modulates atrial electrical remodeling by sponging miR-328 to regulate CACNA1C.[山东大学千佛山医院心内科 4in1shRNA(for TCONS_00075467)慢病毒lenti-RNAi-TCONS_00075467 原代心肌细胞 心房颤动AF的电重构]

12.

Behavioural Neurology. (IF=2.093). Qu, et.al. (2018). MST1 Suppression Reduces Early Brain Injury by Inhibiting the NF-κB/MMP-9 Pathway after Subarachnoid Hemorrhage in Mice.[第三军医大学西南医院神经外科 MST1 AAV-4 in 1 shRNA-GFP 脑室注射 蛛网膜下腔出血]



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