Nat Commun｜王晶/武照伐/李毓龙团队开发新型探针HypnoS揭示胞内腺苷动态变化及调控机制

论文标题：A high-performance fluorescent sensor spatiotemporally reveals cell-type specific regulation of intracellular adenosine in vivo

发表期刊：Nature Communications（IF 14.7）

合作客户：北京大学药学院 王晶 联合 中国科学院遗传与发育生物学研究所 武照伐 及 北京大学生命科学学院 李毓龙团队

· 维真助力 - AAV ·

AAV2/9-hSyn-HypnoS介导海马中HypnoS表达

研究背景

腺苷（Adenosine，Ado）是一种连接细胞内代谢和细胞间通讯的核苷，在调节睡眠和癫痫等过程中起着重要作用。虽然细胞外Ado（eAdo）的功能已被充分证明，但由于缺乏体内检测Ado的方法，目前对细胞内Ado（iAdo）的分布和调节功能的了解受到限制。近期北京大学药学院王晶教授联合中国科学院遗传与发育生物学研究所武照伐研究员及北京大学生命科学学院李毓龙教授团队在 Nature Communications（IF 14.7）上发表文章 A high-performance fluorescent sensor spatiotemporally reveals cell-type specific regulation of intracellular adenosine in vivo，该研究成功开发了首个用于检测胞内腺苷的基因编码荧光探针HypnoS，并借助多种活体成像前沿手段，深入探究了活体动物中胞内腺苷在时空动态上的细胞特异性调控，解析了腺苷稳态的复杂分子调控过程。

研究结果

1、HypnoS检测iAdo动力学

作者基于循环重排绿色荧光蛋白（cpEGFP）与腺苷脱氨酶（PvADA）成功开发了检测胞内腺苷的荧光探针HypnoS和对照探针HypnoS-mut，并在哺乳动物细胞中证明HypnoS是iAdo敏感、特异的传感器。为了评估HypnoS检测脑组织中iAdo动力学的灵敏度，作者使用AAV2/9-hSyn-HypnoS（维真生物提供）在小鼠体内表达HypnoS，发现HypnoS具有单细胞分辨率，在急性脑切片神经元中观察到iAdo水平在2-DG诱导的代谢抑制和电刺激下逐渐升高。相反星形胶质细胞对电刺激的反应中iAdo水平的变化较小，但对100 μM Ado的应用有反应。这些结果表明，与星形胶质细胞相比，神经元中发生了不同的iAdo代谢过程，并突出了HypnoS在脑组织细胞类型特异性iAdo测量中的实用性。鉴于神经元活动和能量代谢在包括果蝇在内的各种物种中密切相关，作者在果蝇体内研究了这种关系，发现HypnoS特异性地响应于Ado，证实了HypnoS报告果蝇中内源性Ado变化的能力。这些发现证明无论在小鼠海马切片还是在果蝇中，HypnoS在监测神经元活性诱导的iAdo增加方面具有高特异性和灵敏度。

图1 HypnoS检测小鼠脑切片iAdo动力学

2、癫痫发作时iAdo的时空动态变化

先前的研究表明，iAdo在包括海马和皮质在内的各种脑区中对癫痫发作起保护作用。作者通过新型HypnoS荧光探针与大视场活体成像技术，率先实现了活体小鼠全脑皮层范围内腺苷在KA诱导的癫痫发作过程中的动态监测。此外作者通过在神经元特异性或星形胶质细胞特异性条件下表达HypnoS，研究了神经元和星形胶质细胞之间iAdo动力学的差异。发现神经元和星形胶质细胞HypnoS在KA注射后均显示出显著的荧光增加，与星形胶质细胞相比，神经元中的Ado升高表现出更长的衰减时间。这意味着体内神经元和星形胶质细胞中不同的iAdo代谢途径。这些结果证明了HypnoS在癫痫发作活动期间以高灵敏度、分子和细胞类型特异性报告小鼠体内iAdo动力学的能力。

图2 体内双光子成像解析细胞类型特异性iAdo动力学

3、ENT1/2调节睡眠-觉醒周期期间的iAdo水平

平衡转运蛋白（ENT1/2）在调节iAdo水平及其与eAdo的偶联中至关重要，不同睡眠-觉醒状态期间的神经元iAdo动力学在很大程度上反映了分离的传感器GRABAdo记录的与神经元活动相关的eAdo动态，表明iAdo和eAdo之间的紧密偶联。在糖酵解抑制和神经元激活条件下，与WT神经元相比，ENT1/2敲除神经元中的iAdo水平显著增加。相反，在以前的ENT1/2 KO神经元研究中，作者使用ENT1/2抑制剂S-250后，没有检测到eAdo的增加。作者进一步比较了睡眠-觉醒周期期间由HypnoS记录的iAdo动力学与野生型小鼠BF中的iAdo动力学，观察到ENT1/2 dKO在觉醒和REM睡眠期间显著增加神经元中的iAdo，而在星形胶质细胞中，在觉醒和REM睡眠期间iAdo显著降低。这些结果证明了HypnoS能在小鼠中检测细胞类型特异性的ENT1/2依赖性Ado转运的能力。

图3 HypnoS揭示ENT1/2介导睡眠觉醒周期中的腺苷酸转运

研究结论

本研究开发了全新的胞内腺苷荧光探针HypnoS，在活体动物中探究了生理及病理过程中胞内腺苷的细胞特异性时空动态，并在神经元及星形胶质细胞中可视化的检测了ENT1/2介导的腺苷跨膜转运，为理解腺苷的作用机制提供了全新工具。

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