维真助力 - 慢病毒

研究结果

1α-syn PFF诱导小胶质细胞溶酶体酸化损伤并损害自噬流

免疫荧光双标记结果显示，α-syn PFF经内吞途径进入小胶质细胞，并与RAB5+、RAB7+及LAMP1+囊泡发生共定位。α-syn PFF处理组小胶质细胞中溶酶体标志物LAMP1和cathepsin D的表达显著降低，提示溶酶体功能受损；同时，溶酶体分布由核旁聚集转变为环绕细胞核的环状排列，可能反映一种代偿性应答。两种pH敏感性荧光探针检测均证实，α-syn PFF处理组溶酶体pH显著升高，酸化损伤程度略弱于V-ATP酶抑制剂BafA1。免疫荧光染色及Western blot分析显示，α-syn在小胶质细胞内大量蓄积，细胞活力显著下降，细胞毒性明显增强；LC3-II和p62水平升高，提示自噬降解受阻。StubRFP-sensGFP-LC3实验进一步证实α-syn PFF可阻断自噬流。从α-syn PFF处理的BV2细胞上清中分离细胞外囊泡（EVs），发现EVs分泌增加，且其中α-syn含量升高，提示病理传播可能加剧。进一步机制探索表明，α-syn PFF可直接结合ATP6V0C，干扰V0-V1结构域组装，导致V-ATP酶复合体功能解离。

2ATP6V0C过表达拯救溶酶体酸化，促进α-syn降解，并减少其细胞外囊泡分泌

为了研究ATP6V0C在α-syn PFF诱导的溶酶体功能障碍中的作用，研究团队构建了ATP6V0C过表达慢病毒。结果显示ATP6V0C的过表达显著降低PFF诱导升高的溶酶体pH，提升细胞存活并恢复Cathepsin D溶酶体水解酶水平；同时促进α-syn降解，减少病理EV释放。在α-syn PFF模型小鼠黑质-纹状体通路中过表达ATP6V0C，可显著改善PD模型小鼠的运动功能障碍，保护黑质多巴胺能神经元免受丢失，并减轻整体PD病理。通过对黑质和纹状体中磷酸化α-syn（P-SYN）进行免疫荧光和免疫组化染色评估，结果显示与对照组相比，α-syn PFF组小鼠纹状体中P-SYN荧光强度和沉积显著增加，黑质中P-SYN沉积亦明显增多；而在α-syn PFF + ATP6V0C组中，纹状体P-SYN荧光强度显著减弱、沉积减少，黑质P-SYN沉积也同样减少。上述结果表明，体内过表达ATP6V0C有助于减少α-syn PFF模型小鼠纹状体及黑质中α-syn的病理聚集。

3α-syn PFF通过PI3K-AKTmTOR-TFEB-ATP6V0C信号轴损害溶酶体酸化

蛋白质组学GSEA分析显示，α-syn PFF处理组中PI3K-AKT-mTOR通路相关蛋白的总表达水平呈下调趋势；而Western blot检测其磷酸化水平（活化形式） 则显著升高，提示该通路被激活（可能与反馈抑制或转录后调控有关）。已知mTORC1激活后可磷酸化TFEB，使其滞留于胞质、阻止核转位。核质分离实验证实，α-syn PFF处理后胞质中TFEB增加，细胞核内TFEB显著减少，表明TFEB核转位受阻。使用siRNA敲低小胶质细胞中TFEB表达后，ATP6V0C的mRNA水平显著下降；在si-TFEB基础上给予TFEB激活剂处理，可部分逆转ATP6V0C的下调，证明TFEB正调控ATP6V0C转录。进一步研究发现，mTOR抑制剂Torin处理可恢复α-syn PFF引起的溶酶体pH升高，降低TNF-α释放及p62水平，并提高细胞活力。使用si-TFEB或mTOR激动剂MHY1485处理均导致溶酶体pH升高；而ATP6V0C过表达可减轻由MHY1485引起的溶酶体酸化障碍，进一步确认ATP6V0C位于该通路下游，是调控溶酶体酸化的关键效应分子。

研究结论

本研究揭示了α-突触核蛋白预形成纤维（α-syn PFF）通过ATP6V0C失调损害小胶质细胞溶酶体功能的一种新机制。通过揭示PI3K-AKT-mTOR-TFEB-ATP6V0C信号轴，研究团队阐明了一条控制溶酶体酸化和α-突触核蛋白清除的关键通路。对该通路进行药理学修复具有显著的治疗潜力，并为缓解帕金森病病理提供了新策略。